Atividade antifúngica de metabólitos produzidos por Streptococcus mutans sobre Candida albicans / Antifungal activity of metabolites produced by Streptococcus mutans on Candida albicans

RESUMO A formação de biofilmes e produção de hifas por Candida albicans são importantes fatores de virulência, principalmente, para a aderência à mucosa e invasão tecidual. A busca por metabólitos secundários produzidos por S. mutans é de suma importância, pois poderá fornecer novas estratégias terapêuticas no combate às infecções por Candida, possibilitando o desenvolvimento de medicamentos capazes de inibir os mecanismos de patogenicidade das espécies desse gênero. Desse modo, o objetivo desse estudo foi obter o extrato bruto e frações a partir do sobrenadante da cultura de 4 h de S. mutans (UA159) e avaliar seus efeitos sobre os mecanismos de patogenicidade de C. albicans (ATCC18804) por meio de estudos in vitro. Após o cultivo de S. mutans, o extrato bruto foi obtido via partição líquido-líquido com acetato de etila (3x) e posteriormente fracionado em coluna de sílica derivatizada C-18 eluída com gradiente MeOH:H2O, fornecendo cinco frações (SM-F1, SM-F2, SM-F3, SM-F4 e SM-F5). A identificação das substâncias contidas no extrato bruto e frações foi realizada utilizando cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CGEM), sendo encontradas as seguintes substâncias: ácido octanóico e uridina no extrato bruto, ácido propanóico, (3R)-3-Methyl-1,4-bis(trimethylsilyl)piperazine-2,5- dione, pirimidina, gulose e oleamida na SM-F1 e ácido nicotínico e triptofano na SM- F2. O extrato bruto e as frações foram submetidos aos ensaios de bioatividade sobre a formação de hifas de C. albicans e analisados por microscopia óptica e microscopia eletrônica de varredura (MEV). O extrato bruto e a fração SM-F2, que resultou em maior inibição das hifas, foram investigados na expressão de genes de C. albicans envolvidos no mecanismo de filamentação (CPH1, EFG1, HWP1, UME6 e YWP1) por PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR). Além disso, o potencial de inibição do extrato bruto, frações SM-F1 e SM-F2 foi avaliado sobre a formação de biofilmes de C. albicans, analisados pela quantificação de células viáveis (UFC/mL) e MEV Os resultados demonstraram inibição significativa na formação de hifas de C. albicans pelo extrato bruto e principalmente, pela SM-F2, com alterações significativas na expressão de todos os genes analisados. O extrato bruto e SM-F2 regularam negativamente a expressão dos genes CPH1, EFG1, HWP1 e UME6, em contrapartida, regularam positivamente a expressão do gene YWP1, envolvido no mecanismo de dispersão das leveduras. Nas análises de UFC/mL, os resultados demonstraram redução nas contagens de C. albicans nos biofilmes formados quando em contato com o extrato bruto, frações SM-F1 e SM-F2 em todas as concentrações testadas, sendo que o extrato bruto reduziu totalmente as células de C. albicans na concentração 15 mg/mL. Os resultados do nosso estudo demonstraram que o extrato bruto e frações de S. mutans apresentaram efeitos inibitórios sobre importantes mecanismos de virulência de C. albicans, fornecendo evidências que S. mutans produz substâncias com ação antifúngica, tornando-o promissor na busca de novos compostos antimicrobianos para prevenção e tratamento das candidoses humanas(AU)

The biofilm formation and hyphae production by Candida albicans are important virulence factors, mainly for mucosal adhesion and tissue invasion. The search for secondary metabolites produced by S. mutans is of great importance, since it may provide new therapeutic strategies against Candida infections, enabling the development of drugs that inhibit the mechanisms of pathogenicity of the species of this genus. Thus, the objective of this study was to obtain the crude extract and fractions from the supernatant of the 4 h culture of S. mutans (UA159) and evaluate their effects on the mechanisms of pathogenicity of C. albicans (ATCC18804) through in vitro studies. After culture of S. mutans, the crude extract was obtained via liquid-liquid partition with ethyl acetate (3x) and then fractionated on a C-18 derivatized silica column eluted with MeOH:H2O gradient, providing five fractions (SM-F1, SM-F2, SM-F3, SM-F4 and SM-F5). The identification of the substances contained in the crude extract and fractions was performed by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS). The following substances were found: octanoic acid and uridine in crude extract, propanoic acid, (3R) -3-methyl -1,4-bis (trimethylsilyl) piperazine-2,5-dione, pyrimidine, gulose and oleamide in SM-F1 and nicotinic acid and tryptophan in SM-F2. The crude extract and fractions were submitted to bioactivity assays on hyphae formation by C. albicans and analyzed by optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM). The crude extract and SM-F2 fraction, which resulted in highest inhibition of hyphae, were investigated in the expression of C. albicans genes involved in the filamentation mechanism (CPH1, EFG1, HWP1, UME6 and YWP1) by quantitative real-time PCR (RT-qPCR). In addition, the potential of inhibition of the crude extract, SM-F1 and SM-F2 fractions in biofilms of C. albicans were evaluated by the quantification of viable cells (CFU/mL) and SEM. The data obtained were statistically analyzed by Graph Pad Prism 5.0, with a significance level of 5%. The results demonstrated a significant inhibition on C. albicans hyphae formation by the crude extract and mainly by SMF2, with significant alterations in the expression of all genes analyzed. The crude extract and SM-F2 negatively regulated the expression of the CPH1, EFG1, HWP1 and UME6 genes, in contrast, positively regulated the expression of the YWP1 gene, involved in the mechanism of yeast dispersion. In the CFU/mL analyzes, the results showed a reduction in the counts of C. albicans in the biofilms formed when in contact with the crude extract, SM-F1 and SM-F2 fractions in all tested concentrations and the crude extract totally reduced C. albicans cells at 15 mg/mL concentration. The results of our study demonstrated that the crude extract and fractions of S. mutans presented inhibitory effects on important mechanisms of virulence of C. albicans, providing evidence that S. mutans produces substances with antifungal action, making it promising in the search for new compounds antimicrobials for the prevention and treatment of human candidoses(AU)

Bioatividade de três espécies vegetais nativas da Floresta Atlântica brasileira frente ao microcrustáceo Artemia salina / Bioactivity of three plant species native to the Brazilian Atlantic Forest front of microcrustacean Artemia salina

Este trabalho teve por objetivo a investigação fitoquímica e propriedades antioxidantes de extratos das folhas de Trigynaea oblongifolia Schltdl (Annonaceae), Ottonia frutescens Trel (Piperaceae), e Bathysa australis (St Hill) Hooz (Rubiaceae), bem como avaliar, in vitro, a letalidade frente ao microcrustáceo Artemia salina Leach. Os extratos foram preparados por maceração em metanol 10% (p/v) por sete dias, à temperatura ambiente. A atividade antioxidante dos extratos foi determinada pela metodologia que utiliza o radical estável DPPH. A toxicidade dos extratos foi avaliada frente ao microcrustáceo A. salina. Os extratos de O. frutescens e B. australis apresentaram as seguintes classes de metabólitos secundários: Alcalóides, Antraquinonas, Cumarinas, Polifenóis (Taninos), Saponinas. Nos extratos de T. oblongifolia, além dos metabólitos citados anteriormente, foi detectada a presença de Flavonóides. A atividade antioxidante, observada em 30 minutos na concentração de 24 µg/mL de extrato, foi de: O. frutescens - 38,3%, T. oblongifolia - 32,3%, e B. australis - 32,1%. A Concentração Letal, CL50, dos extratos em A. salina foi de: O. frutescens - 149,75 ± 1,02 µg/mL, T. oblongifolia - 148,8 ± 1,74 µg/mL, e B. australis - 684 ± 9,04 µg/mL. Neste contexto, destacamos as espécies, nativas da Floresta Atlântica, O. frutescens e T. oblongifolia de grande potencial na bioprospecção de moléculas biologicamente ativas.

This study aimed to carry out phytochemical and antioxidant properties, and assess, in vitro, the lethality of a leaf extract Trigynaea Schltdl oblongifolia Schltdl (Annonaceae), Ottonia frutescens Trel (Piperaceae), Bathysa australis (St Hill) Hooz (Rubiaceae) front of the microcrustaceans Artemia salina Leach. Extracts were prepared by soaking in 10% methanol (w/v) for seven days at room temperature. The antioxidant activity of extracts was determined by the stable radical DPPH method. The toxicity of the extracts was evaluated against the microcrustaceans A. saline. Extracts of O. frutescens and B. australis showed the following classes of secondary metabolites: Alkaloid, Anthraquinones, Coumarins, polyphenols (tannins), Saponin. The extracts from T. oblongifolia, besides the aforementioned metabolites the presence of flavonoids was detected. The antioxidant activity was observed in 30 minutes, the concentration 24 mg/mL of extract was: O. frutescens - 38.3%, T oblongifolia - 32.3%, and B. australis - 32.1%. The lethal concentration, LC50, extracts of A. salina was: O. frutescens - 149.75 ± 1.02 mg/mL, T. oblongifolia - 148.8 ± 1.74 mg/mL, and B. australis - 684 ± 9.04 mg/mL. In this context, we highlight the species, native to the Atlantic Forest, O. frutescens and T. oblongifolia great potential in bioprospecting of biologically active molecules.